斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学研究
作者：孙震晓 魏育林 赵天德 李家实
单位：孙震晓(聊城师范学院生物系，山东 252059)；魏育林 赵天德(中日友好临床医学研究所，北京 100029)；李家实(北京中医药大学中药学院，北京 100029)
关键词：斑蝥素；去甲斑蝥素；细胞凋亡；K562细胞；细胞周期
解剖学报000114 摘 要：目的 研究抗癌药物斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学变化特点。方法 观察药物作用后K562细胞形态的动态变化、一般及超微结构特征，并用流式细胞术分析斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞周期的关系。结果 2mg/L斑蝥素及10mg/L去甲斑蝥素作用24h，部分K562细胞质膜突起，染色质异常凝集，原位复染显示这些细胞质膜的通透性没有增强，DNA琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特有的“梯子”状带纹。电镜下，加药处理组中部分细胞染色质凝集成块，没有核膜包被，部分细胞染色质靠核膜边集呈新月形，胞浆浓缩，内质网结构正常或有扩张，呈现典型的凋亡细胞形态。流式细胞术分析结合细胞形态学研究表明，斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞G2/M期阻滞相关。结论 斑蝥素及去甲斑蝥素能够诱导K562细胞凋亡，凋亡大部分发生在细胞周期的M期，也有少量发生在间期，是多点启动的。
, 百拇医药
分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-56
STUDIES ON APOPTOTIC CYTOLOGY OF K562 HUMAN
MYELOID LEUKEMIA CELLS INDUCED BY
CANTHARIDIN AND NORCANTHARIDIN
SUN Zhen-xiao
(Liaocheng Teachers University,Shandong 252059,China)
WEI Yu-lin
, 百拇医药
(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)
ZHAO Tian-de
(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)
LI Jia-shi
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029,China)
Abstract：Objective Studying the apoptotic cytology of K562 cells induced by cantharidin(CA) and norcantharidin(NCTD). Methods Observing morphological changes and ultrastructural features of treated K562 cells by phase contrast microscope and electron microscope.Relation between apoptosis and cell cycle of treated K562 cells was examined by fluorescence-activated cell sorting (FACS)analysis. Results Some K562 cells show cell membrane bubbling and nuclear chromatin compacting after treated with 2mg/L CA or 10mg/L NCTD for 24h.The membrane permeability of treated K562 cells proved no increase by counterstaining in situ.An apoptosis characteristic DNA“Ladder” detected by using agarose gel electrophoresis.Several masses of condensed chromatin without nuclear membrane were observed in some treated K562 cells,while chromatin of some other cells tended to marginate in crescents around the nuclear envelope with compacting cytoplasm,normal or slightly expanded endoplasmic reticulum,which presented typical morphology of apoptosis.FACS analysis of DNA profiles and cell morphological studies indicated that the apoptosis was related to tumor cell G2/M phase blocking. Conclusions Apoptosis was induced by CA and NCTD in K562 cells,most of which initiated in mitosis phase,others in interphase.
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Key words：Cantharidin; Norcantharidin; Apoptosis; K562 cell; Cell cycle▲
斑蝥为常用中药之一，具有攻坚蚀疮、破血散结的功能。斑蝥体内所含斑蝥素(cantharidin,CA)已证明有抗肿瘤活性。临床上，CA能够缓解原发性肝癌患者病情，提高1年生存率。动物实验表明，CA可以刺激骨髓产生白细胞，使外周血中白细胞数升高(升白)。但是CA有剧烈毒性，小鼠急性LD50(ip)为1.0mg/kg。临床应用CA有强烈的泌尿系刺激作用，使患者难以坚持治疗。而且由于CA产生泌尿系刺激剂量低于其升白剂量，临床应用剂量下不能表现其升白作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)由呋喃及顺丁烯二酸酐加成、氢化而得，与CA相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同，其毒性显著降低，小鼠急性LD50(ip)为12.5mg/kg。临床应用NCTD治疗多种癌症，以原发性肝癌为主，毒副作用大大降低，升白效果显著[1，2]。NCTD能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡[3]。我们研究了CA及NCTD诱导K562细胞凋亡的细胞学变化特点。
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材料和方法
1. 细胞系及培养条件
人红白血病K562细胞(中日友好临床医学研究所细胞室冻存)接种于含10%小牛血清、105IU/L青霉素及105IU/L链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2. 药品与试剂
CA用丙酮自南方大斑蝥(Mylabris phalerata Pallas.)的干燥虫体中提取、精制而得[4，5]。NCTD由呋喃及顺丁烯二酸酐经加成、氢化得到[6]，(北京第四制药厂王广生教授惠赠)。两药均在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNase A和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南[7]分别配成10g/L和20g/L，-20℃存放。Nonidet P-40(NP-40)：Fluka产品。
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3. 细胞的增殖抑制曲线
参照文献[8]，取对数生长期的细胞用生长培养基配成1×108/L悬液，在50ml培养瓶中接种10ml。加入待试药物100μl置含5%CO2的37℃培养箱中培养，在培养即刻及培养后1、2、3d从对照组及加药处理组各取样40μl，加0.4% Trypan blue 10μl，混匀，反应5min后，血球计数板计数活细胞，15min内计完，每个样品均设3个平行组，结果取3组的平均值，最后以K562细胞生长抑制率对时间作图。
细胞生长抑制率=
4. 细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献[9]收集DNA片段，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄影。
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5. 细胞形态学观察
5.1 生活细胞的形态学：在日本Olympus IMT-2型倒置显微镜(带保温装置)下对活细胞进行动态观察。
5.2 Wright-Giemsa染液染色观察细胞及核的形态：细胞推片或离心涂片，固定后，Wright-Giemsa染液染色，光镜下观察。
5.3 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜下观察。
6. 流式细胞测定及细胞周期分析
药物处理后不同时间收集细胞，4℃70%乙醇固定24h以上，100mg/L RNase A 37℃消化30min，100mg/L碘化丙啶(PI)4℃染色30min以上。FACS420流式细胞仪上测定，细胞周期分析用SOBR(Sum of Broadened Rectangles Model)软件，低于G1期DNA含量的细胞为部分凋亡细胞或凋亡小体。
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结果
1. CA及NCTD对K562细胞增殖的抑制作用
从图1可以看出，2mg/L CA及10mg/L NCTD均能强烈抑制K562细胞增殖。
图1 CA及NCTD对K562细胞增值的抑制作用
Fig.1 The inhibition effects of CA and NCTD on proliferation of K562 cells.
2. DNA琼脂糖凝胶电泳
如图2a,b所示，分别用2mg/L CA及10mg/L NCTD处理K562细胞24h，提取各对照组及加药组细胞的DNA片断电泳，加药组均出现凋亡特有的“梯子”状带纹，而对照组没有发现类似的DNA片断的存在。
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图2 琼脂糖凝胶电泳显示2mg/L CA(A)及10mg/L NCTD(B)作用
人红白血病K562细胞24h后的“梯子”状带纹
Fig.2 DNA“Ladder”of K562 cells treated with 2mg/L CA(A)and 10mg/L NCTD(B) for 24h
3. 细胞的形态学观察
2mg/L CA及6～10mg/L NCTD作用K562细胞8h后，细胞形态发生很大变化，相差显微镜下观察，可见K562细胞先变大变圆，随后胞浆呈现不规则突起，继而大部分细胞拉长成“豆角”样，随后，部分细胞胞膜收缢或以类似出芽方式形成很多膜包被的小体(图4，5)。Wright-Giemsa染液染色，发现变大变圆的细胞及“豆角”样细胞均为处于有丝分裂期的细胞，其染色体的运动有异常，24h时，部分细胞出现染色体断裂、核固缩、碎裂等典型的凋亡细胞形态，形成的小体往往包含部分胞浆和部分染色质碎块(图6～8)。
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为观察CA及NCTD作用K562细胞后细胞死亡的性质，在2mg/L CA或10mg/L NCTD作用K562细胞24h后，我们用原位复染法[10]染色，发现98%以上的细胞为Trypan blue拒染细胞，洗去Trypan blue染液后，以Wright-Giemsa染液复染，发现大多数细胞出现有丝分裂期染色体断裂、染色体运动异常，核固缩、碎裂等变化，进一步证实CA及NCTD杀伤K562细胞的机制主要是诱导其发生凋亡。
透射电子显微镜下，观察2mg/L CA及10mg/L NCTD作用K562细胞24h后细胞超微结构的变化。可见对照组的K562细胞中细胞核及线粒体、内质网等细胞器结构清晰，核占细胞体积的大部分(图9)；加药处理组中部分细胞核明显固缩、碎裂，没有核膜包被(图11，14)，部分细胞染色质靠核膜边集，呈新月形(图10，12,13)，胞浆浓缩，内质网等细胞器结构正常或有扩张，呈现典型的凋亡细胞形态；可见正在形成的凋亡小体(图14)；凋亡细胞及凋亡小体均有完整的细胞膜包被，内含有核膜包被或无核膜包被的染色质团块，有核膜包被的染色质团块，其核周间隙明显扩张，核膜孔也明显扩大(图12)；另外，还发现许多凋亡细胞内，围绕凝集的染色质团块及沿胞膜内侧富集有成层排列的内质网，有的与胞膜相连，似与凋亡小体的形成有关(图14)。
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4. 细胞凋亡与细胞周期的关系
样品的流式细胞术及细胞周期分析结果见图3。2mg/L CA及10mg/L NCTD作用K562细胞12h，部分细胞被阻滞在G2/M期，DNA含量小于G1期的细胞(形态学上为凋亡细胞或凋亡小体)很少(分别为3.1%和4.2%，对照为3.1%)。24h，CA处理组G2/M期细胞数维持较高水平，NCTD处理组已经下降，两处理组中DNA含量小于G1期的细胞大量增加(分别为14.6%和23.4%)。36h,CA处理组G2/M期细胞数继续增加，NCTD处理组继续下降，两处理组中DNA含量小于G1期的细胞数继续增加(分别为18.8%和33.2%)。另外，CA处理组在48h G2/M期细胞数也下降(为25%)，同时G1前期细胞数大量增加(为27.4%)。以上说明CA及NCTD对K562细胞凋亡的诱导与G2/M期阻滞相关，10mg/L NCTD的作用强度较2mg/L CA大。通过对加药组细胞的形态学变化作连续观察，发现CA及NCTD作用后，大部分细胞首先呈现M期阻滞，继而染色体断裂或不对称分离，最后表现核固缩、碎裂，形成凋亡小体(图6～8)。细胞超微结构的研究也发现，加药组很多凋亡细胞中凝集的染色质团块无核膜包被，似由部分染色体或染色体片断自有丝分裂期直接凝集而成(图11，14)。因而推断CA及NCTD诱导K562细胞凋亡大部分发生在M期。但是对加药组细胞超微结构的大量研究又发现，少量凋亡细胞中的染色质团块有核膜包被，有的还出现细胞凋亡早期的“染色质靠核膜边集”现象，说明仍有少量细胞凋亡发生在细胞分裂间期，CA及NCTD诱导K562细胞凋亡是多点启动的。
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图3 CA及NCTD作用K562细胞后不同时相的DNA组方图。横坐标代表相对DNA含量，纵坐标代表细胞数
Fig.3 The DNA histogram of K562 cells treated with CA and NCTD.X-axis stands for relative DNA content,Y-axis represents cell numbers.
图4 对照组中生活的K562细胞，细胞近圆形，核大而清晰(40×3.3)
Fig.4 Control culture of living K562 cells (40×3.3)
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图5 10mg/L NCTD作用24h，大部分K562细胞呈“豆角”状(↑)，有的细胞胞膜收缢或以类似出芽方式形成凋亡小体(▲)(40×3.3)
Fig.5 K562 cells treated with 10mg/L NCTD for 24h,many cells look like“kidney beans”(↑),(▲)indicates apoptotic K562 cells(40×3.3).
图6，7 2mg/L CA作用24h，大部分K562细胞出现M期阻滞(↑)，有的出现染色体断裂或染色体异常分离和凝集(Δ)，有的细胞核固缩、碎裂，呈凋亡细胞形态(▲),W-G染色(40×3.3)
, 百拇医药 Fig.6,7 K562 cells treated with 2mg/L CA for 24h,(↑)indicates mitotic arrest of chromosome,(Δ) indicates chromosome breaking,abnormal distribution and condensation of chromosomes,(▲)indicates apoptotic K562 cells,W-G staining(40×3.3).
图8 6mg/L NCTD作用24h,(↑)示K562细胞M期阻滞，染色体不对称分离，(Δ)示凋亡细胞：细胞质浓缩，核碎裂，(▲)示正在以类似出芽方式形成凋亡小体及已形成的凋亡小体，W-G染色(40×3.3)2mg/L CA或10mg/L NCTD作用24h,K562细胞超微结构的变化，标尺长度均代表1.0μm
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Fig.8 K562 cells treated with 6mg/L NCTD for 24h,(↑)indicates mitotic arrest and assymetrical distribution of chromosome,(Δ)indicates apoptotic K562 cells with chromatin condensation and nuclear breaking,(▲)indicates apoptotic bodies,W-G staining(40×3.3).Ultrastructural features of K562 cells treated with 2mg/L CA or 10mg/L NCTD for 24h,Bar=1.0μm:
图9 对照组中1个间期细胞，可见其细胞核占细胞体积的大部分，结构清晰，线粒体、内质网结构清晰
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Fig.9 An interphase cell from a control culture,note the normal nucleus,clear mitochondria and endoplasmic reticulum.
图10 示2μm/L CA作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，可见其染色质靠核膜边集，呈新月形
Fig.10 Showing K562 cell line treated with CA for 24h:an apoptotic cell with condensed chromatin marginated in crescents around the nuclear envelope.
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图11 示2mg/L CA作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，核碎裂，无核膜包被
Fig.11 showing K562 cell line treated with CA for 24h:an apoptotic cell with irrevesibly condensed chromatin without nuclear membrane.
图12 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，其染色质靠核膜边集，以类似出芽的方式形成有核膜包被或无核膜包被的染色质团块，核周间隙扩张，核孔(↑)扩大，内质网靠细胞膜排列，略有扩张并与细胞膜相连
Fig.12 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic cell with budding nucleus and expanded perinuclear space,expanded nuclear pores indicated by the arrows(↑).
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图13 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，可见其染色质靠核膜边集，呈新月形，胞浆浓缩
Fig.13 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic cell with condensed chromatin marginated in crescents around the nuclear envelope.
图14 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡细胞及其形成的凋亡小体，可见细胞浆中几块浓缩的染色质团块无核膜包被，轻度扩张的内质网围绕裸露的的染色质团块或沿核膜内侧成层排列，有的可见与细胞膜相连，(↑)示凋亡细胞正在形成的凋亡小体
Fig.14 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic K562 cell with several masses of condensed chromatin without nuclear membrane but surrounded by slightly expanded endoplasmic reticulum.Apoptotic bodies are indicated by arrows(↑).
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讨论
我们通过细胞的一般形态学、超微结构观察及DNA琼脂糖凝胶电泳分析、流式细胞术测定等证明CA及NCTD杀伤人红白血病K562细胞的机制主要是诱导其发生凋亡，且特点相似。这从一个新的角度阐明了CA及NCTD的构效关系：CA及NCTD的基本结构具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，所以CA二甲基的去除并不明显影响其抗肿瘤活性。
流式细胞术测定结合细胞形态学研究，我们发现CA及NCTD可以诱导K562细胞在有丝分裂期凋亡。与以往报道发生在细胞分裂间期的凋亡不同，这种发生于M期的细胞凋亡在形态学变化及流式细胞图谱特征上均有其独特性。从形态学变化上看，细胞首先发生M期阻滞，随后染色体断裂、多极或不对称分离，继而染色质凝集成若干团块、胞浆浓缩，最后胞膜内陷或以类似出芽的方式形成凋亡小体而消亡。与发生在间期的细胞凋亡在流式图谱上形成特殊的“凋亡峰”不同，发生在M期的细胞凋亡不形成“凋亡峰”：M期细胞(4倍体)凋亡时形成的凋亡细胞DNA含量大小不等，流式细胞计不能分辨落在G1和S期的凋亡细胞与真正的G1和S期细胞，因而图谱上G1前期、G1和S期的细胞数均增加，M期细胞数相对减少，形成一种特殊的图谱(图3)。发生在间期的细胞凋亡与发生在M期的细胞凋亡机制有何异同，目前尚不清楚，相关的研究仍在进行中。
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已有实验证明，CA在小鼠肝细胞浆中与蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)相结合[11]，CA及NCTD是PP2A的抑制剂，同时也是蛋白磷酸酯酶1(PP1)的抑制剂[12]。而PP2A和PP1在细胞周期中的转换控制点和G2及M期起重要作用[13，14]。PP1的功能被抑制，会使一种重要的周期蛋白Rb不能去磷酸化，细胞不能完成由M→G1期的正常转换，会出现M期阻滞等变化，而PP2A活性被抑制，会促进细胞越过G2→M期“检查点”，使一些复制未完成或DNA受损的细胞也进入M期，进行异常有丝分裂，最终使细胞发生凋亡。因而我们推测CA及NCTD使肿瘤细胞发生M期阻滞，大部分细胞在M期启动凋亡与其抑制PP2A和PP1的活性密切相关。深入研究CA及NCTD与PP2A、PP1及细胞周期的关系，将会进一步揭示CA及NCTD诱导肿瘤细胞凋亡的机制。■
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
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作者简介：孙震晓，(1967—)，女，山东胶州市人，医学博士，副教授
参考文献：
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[4]张豁中，温玉麟.动物活性成分化学[M].天津：天津科学技术出版社，1995：1751～1752.
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收稿日期：1998-11-17
修回日期：1999-04-30, 百拇医药
单位：孙震晓(聊城师范学院生物系，山东 252059)；魏育林 赵天德(中日友好临床医学研究所，北京 100029)；李家实(北京中医药大学中药学院，北京 100029)
关键词：斑蝥素；去甲斑蝥素；细胞凋亡；K562细胞；细胞周期
解剖学报000114 摘 要：目的 研究抗癌药物斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学变化特点。方法 观察药物作用后K562细胞形态的动态变化、一般及超微结构特征，并用流式细胞术分析斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞周期的关系。结果 2mg/L斑蝥素及10mg/L去甲斑蝥素作用24h，部分K562细胞质膜突起，染色质异常凝集，原位复染显示这些细胞质膜的通透性没有增强，DNA琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特有的“梯子”状带纹。电镜下，加药处理组中部分细胞染色质凝集成块，没有核膜包被，部分细胞染色质靠核膜边集呈新月形，胞浆浓缩，内质网结构正常或有扩张，呈现典型的凋亡细胞形态。流式细胞术分析结合细胞形态学研究表明，斑蝥素及去甲斑蝥素诱导K562细胞凋亡与细胞G2/M期阻滞相关。结论 斑蝥素及去甲斑蝥素能够诱导K562细胞凋亡，凋亡大部分发生在细胞周期的M期，也有少量发生在间期，是多点启动的。
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分类号：R979.1 文献标识码：A
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CANTHARIDIN AND NORCANTHARIDIN
SUN Zhen-xiao
(Liaocheng Teachers University,Shandong 252059,China)
WEI Yu-lin
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(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)
ZHAO Tian-de
(China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029,China)
LI Jia-shi
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029,China)
Abstract：Objective Studying the apoptotic cytology of K562 cells induced by cantharidin(CA) and norcantharidin(NCTD). Methods Observing morphological changes and ultrastructural features of treated K562 cells by phase contrast microscope and electron microscope.Relation between apoptosis and cell cycle of treated K562 cells was examined by fluorescence-activated cell sorting (FACS)analysis. Results Some K562 cells show cell membrane bubbling and nuclear chromatin compacting after treated with 2mg/L CA or 10mg/L NCTD for 24h.The membrane permeability of treated K562 cells proved no increase by counterstaining in situ.An apoptosis characteristic DNA“Ladder” detected by using agarose gel electrophoresis.Several masses of condensed chromatin without nuclear membrane were observed in some treated K562 cells,while chromatin of some other cells tended to marginate in crescents around the nuclear envelope with compacting cytoplasm,normal or slightly expanded endoplasmic reticulum,which presented typical morphology of apoptosis.FACS analysis of DNA profiles and cell morphological studies indicated that the apoptosis was related to tumor cell G2/M phase blocking. Conclusions Apoptosis was induced by CA and NCTD in K562 cells,most of which initiated in mitosis phase,others in interphase.
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Key words：Cantharidin; Norcantharidin; Apoptosis; K562 cell; Cell cycle▲
斑蝥为常用中药之一，具有攻坚蚀疮、破血散结的功能。斑蝥体内所含斑蝥素(cantharidin,CA)已证明有抗肿瘤活性。临床上，CA能够缓解原发性肝癌患者病情，提高1年生存率。动物实验表明，CA可以刺激骨髓产生白细胞，使外周血中白细胞数升高(升白)。但是CA有剧烈毒性，小鼠急性LD50(ip)为1.0mg/kg。临床应用CA有强烈的泌尿系刺激作用，使患者难以坚持治疗。而且由于CA产生泌尿系刺激剂量低于其升白剂量，临床应用剂量下不能表现其升白作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)由呋喃及顺丁烯二酸酐加成、氢化而得，与CA相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同，其毒性显著降低，小鼠急性LD50(ip)为12.5mg/kg。临床应用NCTD治疗多种癌症，以原发性肝癌为主，毒副作用大大降低，升白效果显著[1，2]。NCTD能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡[3]。我们研究了CA及NCTD诱导K562细胞凋亡的细胞学变化特点。
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材料和方法
1. 细胞系及培养条件
人红白血病K562细胞(中日友好临床医学研究所细胞室冻存)接种于含10%小牛血清、105IU/L青霉素及105IU/L链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2. 药品与试剂
CA用丙酮自南方大斑蝥(Mylabris phalerata Pallas.)的干燥虫体中提取、精制而得[4，5]。NCTD由呋喃及顺丁烯二酸酐经加成、氢化得到[6]，(北京第四制药厂王广生教授惠赠)。两药均在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNase A和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南[7]分别配成10g/L和20g/L，-20℃存放。Nonidet P-40(NP-40)：Fluka产品。
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3. 细胞的增殖抑制曲线
参照文献[8]，取对数生长期的细胞用生长培养基配成1×108/L悬液，在50ml培养瓶中接种10ml。加入待试药物100μl置含5%CO2的37℃培养箱中培养，在培养即刻及培养后1、2、3d从对照组及加药处理组各取样40μl，加0.4% Trypan blue 10μl，混匀，反应5min后，血球计数板计数活细胞，15min内计完，每个样品均设3个平行组，结果取3组的平均值，最后以K562细胞生长抑制率对时间作图。
细胞生长抑制率=
4. 细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献[9]收集DNA片段，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄影。
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5. 细胞形态学观察
5.1 生活细胞的形态学：在日本Olympus IMT-2型倒置显微镜(带保温装置)下对活细胞进行动态观察。
5.2 Wright-Giemsa染液染色观察细胞及核的形态：细胞推片或离心涂片，固定后，Wright-Giemsa染液染色，光镜下观察。
5.3 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜下观察。
6. 流式细胞测定及细胞周期分析
药物处理后不同时间收集细胞，4℃70%乙醇固定24h以上，100mg/L RNase A 37℃消化30min，100mg/L碘化丙啶(PI)4℃染色30min以上。FACS420流式细胞仪上测定，细胞周期分析用SOBR(Sum of Broadened Rectangles Model)软件，低于G1期DNA含量的细胞为部分凋亡细胞或凋亡小体。
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结果
1. CA及NCTD对K562细胞增殖的抑制作用
从图1可以看出，2mg/L CA及10mg/L NCTD均能强烈抑制K562细胞增殖。
图1 CA及NCTD对K562细胞增值的抑制作用
Fig.1 The inhibition effects of CA and NCTD on proliferation of K562 cells.
2. DNA琼脂糖凝胶电泳
如图2a,b所示，分别用2mg/L CA及10mg/L NCTD处理K562细胞24h，提取各对照组及加药组细胞的DNA片断电泳，加药组均出现凋亡特有的“梯子”状带纹，而对照组没有发现类似的DNA片断的存在。
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图2 琼脂糖凝胶电泳显示2mg/L CA(A)及10mg/L NCTD(B)作用
人红白血病K562细胞24h后的“梯子”状带纹
Fig.2 DNA“Ladder”of K562 cells treated with 2mg/L CA(A)and 10mg/L NCTD(B) for 24h
3. 细胞的形态学观察
2mg/L CA及6～10mg/L NCTD作用K562细胞8h后，细胞形态发生很大变化，相差显微镜下观察，可见K562细胞先变大变圆，随后胞浆呈现不规则突起，继而大部分细胞拉长成“豆角”样，随后，部分细胞胞膜收缢或以类似出芽方式形成很多膜包被的小体(图4，5)。Wright-Giemsa染液染色，发现变大变圆的细胞及“豆角”样细胞均为处于有丝分裂期的细胞，其染色体的运动有异常，24h时，部分细胞出现染色体断裂、核固缩、碎裂等典型的凋亡细胞形态，形成的小体往往包含部分胞浆和部分染色质碎块(图6～8)。
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为观察CA及NCTD作用K562细胞后细胞死亡的性质，在2mg/L CA或10mg/L NCTD作用K562细胞24h后，我们用原位复染法[10]染色，发现98%以上的细胞为Trypan blue拒染细胞，洗去Trypan blue染液后，以Wright-Giemsa染液复染，发现大多数细胞出现有丝分裂期染色体断裂、染色体运动异常，核固缩、碎裂等变化，进一步证实CA及NCTD杀伤K562细胞的机制主要是诱导其发生凋亡。
透射电子显微镜下，观察2mg/L CA及10mg/L NCTD作用K562细胞24h后细胞超微结构的变化。可见对照组的K562细胞中细胞核及线粒体、内质网等细胞器结构清晰，核占细胞体积的大部分(图9)；加药处理组中部分细胞核明显固缩、碎裂，没有核膜包被(图11，14)，部分细胞染色质靠核膜边集，呈新月形(图10，12,13)，胞浆浓缩，内质网等细胞器结构正常或有扩张，呈现典型的凋亡细胞形态；可见正在形成的凋亡小体(图14)；凋亡细胞及凋亡小体均有完整的细胞膜包被，内含有核膜包被或无核膜包被的染色质团块，有核膜包被的染色质团块，其核周间隙明显扩张，核膜孔也明显扩大(图12)；另外，还发现许多凋亡细胞内，围绕凝集的染色质团块及沿胞膜内侧富集有成层排列的内质网，有的与胞膜相连，似与凋亡小体的形成有关(图14)。
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4. 细胞凋亡与细胞周期的关系
样品的流式细胞术及细胞周期分析结果见图3。2mg/L CA及10mg/L NCTD作用K562细胞12h，部分细胞被阻滞在G2/M期，DNA含量小于G1期的细胞(形态学上为凋亡细胞或凋亡小体)很少(分别为3.1%和4.2%，对照为3.1%)。24h，CA处理组G2/M期细胞数维持较高水平，NCTD处理组已经下降，两处理组中DNA含量小于G1期的细胞大量增加(分别为14.6%和23.4%)。36h,CA处理组G2/M期细胞数继续增加，NCTD处理组继续下降，两处理组中DNA含量小于G1期的细胞数继续增加(分别为18.8%和33.2%)。另外，CA处理组在48h G2/M期细胞数也下降(为25%)，同时G1前期细胞数大量增加(为27.4%)。以上说明CA及NCTD对K562细胞凋亡的诱导与G2/M期阻滞相关，10mg/L NCTD的作用强度较2mg/L CA大。通过对加药组细胞的形态学变化作连续观察，发现CA及NCTD作用后，大部分细胞首先呈现M期阻滞，继而染色体断裂或不对称分离，最后表现核固缩、碎裂，形成凋亡小体(图6～8)。细胞超微结构的研究也发现，加药组很多凋亡细胞中凝集的染色质团块无核膜包被，似由部分染色体或染色体片断自有丝分裂期直接凝集而成(图11，14)。因而推断CA及NCTD诱导K562细胞凋亡大部分发生在M期。但是对加药组细胞超微结构的大量研究又发现，少量凋亡细胞中的染色质团块有核膜包被，有的还出现细胞凋亡早期的“染色质靠核膜边集”现象，说明仍有少量细胞凋亡发生在细胞分裂间期，CA及NCTD诱导K562细胞凋亡是多点启动的。
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图3 CA及NCTD作用K562细胞后不同时相的DNA组方图。横坐标代表相对DNA含量，纵坐标代表细胞数
Fig.3 The DNA histogram of K562 cells treated with CA and NCTD.X-axis stands for relative DNA content,Y-axis represents cell numbers.
图4 对照组中生活的K562细胞，细胞近圆形，核大而清晰(40×3.3)
Fig.4 Control culture of living K562 cells (40×3.3)
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图5 10mg/L NCTD作用24h，大部分K562细胞呈“豆角”状(↑)，有的细胞胞膜收缢或以类似出芽方式形成凋亡小体(▲)(40×3.3)
Fig.5 K562 cells treated with 10mg/L NCTD for 24h,many cells look like“kidney beans”(↑),(▲)indicates apoptotic K562 cells(40×3.3).
图6，7 2mg/L CA作用24h，大部分K562细胞出现M期阻滞(↑)，有的出现染色体断裂或染色体异常分离和凝集(Δ)，有的细胞核固缩、碎裂，呈凋亡细胞形态(▲),W-G染色(40×3.3)
, 百拇医药 Fig.6,7 K562 cells treated with 2mg/L CA for 24h,(↑)indicates mitotic arrest of chromosome,(Δ) indicates chromosome breaking,abnormal distribution and condensation of chromosomes,(▲)indicates apoptotic K562 cells,W-G staining(40×3.3).
图8 6mg/L NCTD作用24h,(↑)示K562细胞M期阻滞，染色体不对称分离，(Δ)示凋亡细胞：细胞质浓缩，核碎裂，(▲)示正在以类似出芽方式形成凋亡小体及已形成的凋亡小体，W-G染色(40×3.3)2mg/L CA或10mg/L NCTD作用24h,K562细胞超微结构的变化，标尺长度均代表1.0μm
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Fig.8 K562 cells treated with 6mg/L NCTD for 24h,(↑)indicates mitotic arrest and assymetrical distribution of chromosome,(Δ)indicates apoptotic K562 cells with chromatin condensation and nuclear breaking,(▲)indicates apoptotic bodies,W-G staining(40×3.3).Ultrastructural features of K562 cells treated with 2mg/L CA or 10mg/L NCTD for 24h,Bar=1.0μm:
图9 对照组中1个间期细胞，可见其细胞核占细胞体积的大部分，结构清晰，线粒体、内质网结构清晰
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Fig.9 An interphase cell from a control culture,note the normal nucleus,clear mitochondria and endoplasmic reticulum.
图10 示2μm/L CA作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，可见其染色质靠核膜边集，呈新月形
Fig.10 Showing K562 cell line treated with CA for 24h:an apoptotic cell with condensed chromatin marginated in crescents around the nuclear envelope.
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图11 示2mg/L CA作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，核碎裂，无核膜包被
Fig.11 showing K562 cell line treated with CA for 24h:an apoptotic cell with irrevesibly condensed chromatin without nuclear membrane.
图12 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，其染色质靠核膜边集，以类似出芽的方式形成有核膜包被或无核膜包被的染色质团块，核周间隙扩张，核孔(↑)扩大，内质网靠细胞膜排列，略有扩张并与细胞膜相连
Fig.12 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic cell with budding nucleus and expanded perinuclear space,expanded nuclear pores indicated by the arrows(↑).
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图13 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡的K562细胞，可见其染色质靠核膜边集，呈新月形，胞浆浓缩
Fig.13 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic cell with condensed chromatin marginated in crescents around the nuclear envelope.
图14 示10mg/L NCTD作用24h，加药组中1个凋亡细胞及其形成的凋亡小体，可见细胞浆中几块浓缩的染色质团块无核膜包被，轻度扩张的内质网围绕裸露的的染色质团块或沿核膜内侧成层排列，有的可见与细胞膜相连，(↑)示凋亡细胞正在形成的凋亡小体
Fig.14 showing K562 cell line treated with NCTD for 24h:an apoptotic K562 cell with several masses of condensed chromatin without nuclear membrane but surrounded by slightly expanded endoplasmic reticulum.Apoptotic bodies are indicated by arrows(↑).
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讨论
我们通过细胞的一般形态学、超微结构观察及DNA琼脂糖凝胶电泳分析、流式细胞术测定等证明CA及NCTD杀伤人红白血病K562细胞的机制主要是诱导其发生凋亡，且特点相似。这从一个新的角度阐明了CA及NCTD的构效关系：CA及NCTD的基本结构具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，所以CA二甲基的去除并不明显影响其抗肿瘤活性。
流式细胞术测定结合细胞形态学研究，我们发现CA及NCTD可以诱导K562细胞在有丝分裂期凋亡。与以往报道发生在细胞分裂间期的凋亡不同，这种发生于M期的细胞凋亡在形态学变化及流式细胞图谱特征上均有其独特性。从形态学变化上看，细胞首先发生M期阻滞，随后染色体断裂、多极或不对称分离，继而染色质凝集成若干团块、胞浆浓缩，最后胞膜内陷或以类似出芽的方式形成凋亡小体而消亡。与发生在间期的细胞凋亡在流式图谱上形成特殊的“凋亡峰”不同，发生在M期的细胞凋亡不形成“凋亡峰”：M期细胞(4倍体)凋亡时形成的凋亡细胞DNA含量大小不等，流式细胞计不能分辨落在G1和S期的凋亡细胞与真正的G1和S期细胞，因而图谱上G1前期、G1和S期的细胞数均增加，M期细胞数相对减少，形成一种特殊的图谱(图3)。发生在间期的细胞凋亡与发生在M期的细胞凋亡机制有何异同，目前尚不清楚，相关的研究仍在进行中。
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已有实验证明，CA在小鼠肝细胞浆中与蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)相结合[11]，CA及NCTD是PP2A的抑制剂，同时也是蛋白磷酸酯酶1(PP1)的抑制剂[12]。而PP2A和PP1在细胞周期中的转换控制点和G2及M期起重要作用[13，14]。PP1的功能被抑制，会使一种重要的周期蛋白Rb不能去磷酸化，细胞不能完成由M→G1期的正常转换，会出现M期阻滞等变化，而PP2A活性被抑制，会促进细胞越过G2→M期“检查点”，使一些复制未完成或DNA受损的细胞也进入M期，进行异常有丝分裂，最终使细胞发生凋亡。因而我们推测CA及NCTD使肿瘤细胞发生M期阻滞，大部分细胞在M期启动凋亡与其抑制PP2A和PP1的活性密切相关。深入研究CA及NCTD与PP2A、PP1及细胞周期的关系，将会进一步揭示CA及NCTD诱导肿瘤细胞凋亡的机制。■
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
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作者简介：孙震晓，(1967—)，女，山东胶州市人，医学博士，副教授
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收稿日期：1998-11-17
修回日期：1999-04-30, 百拇医药
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